在生物制品和细胞治疗领域，支原体检查是保证产品和治疗安全的重要一环。生物源性原材料、采用细胞培养技术制备的疫苗、抗体，以及细胞或基因治疗产品在生产过程的不同阶段都要进行支原体污染的检查。

传统支原体检查方法是培养法和指示细胞培养法，并为药典所认可和收录。近年来，『支原体qPCR检测』在工业领域的应用越来越多，但在项目申报前，先需要进行方法学验证，依据药典，在检测限、特异性和耐用性方面达到要求后，才能替代传统的检查方法。

就笔者所知，在适合工业的支原体检测和方法验证方面，德国Minerva Biolabs（简称MB）公司已有很成熟的产品及商业化应用，它不仅提供有符合药典的『支原体qPCR检测』试剂盒，而且有一系列支原体标准品及辅助产品，用于qPCR方法的全面验证。这些产品性价比也较高，许多客户都在使用。

下面，笔者就『支原体qPCR检测』方法验证的一般要求、德国MB公司提供的『支原体qPCR检测』的方法验证产品阐述如下。

 

一、『支原体qPCR检测』方法验证的一般要求

各国药典对支原体核酸扩增检测方法（简称NAT法）的验证要求略有出入，但均要求对检出限、特异性和耐用性进行验证。在检测方法上，均要求先做样本的支原体DNA抽提，再进行支原体检测。

如使用商品化试剂盒，则除了需要试剂盒生产商提供完整的方法学验证数据外，还需要使用者验证试剂盒对其样本的适用性，以及试剂盒表现出预期的性能（例如检测限、耐用性、是否存在与细菌的交叉反应）。这些必须由使用者自己来证明。

在检出限验证中，欧洲药典（简称EP）规定了污染细胞的常见9种支原体，要求NAT如替代培养法，对这9种支原体的检测限需均达到10CFU/ml。其中如果生产中未采用昆虫或植物源材料，可不必检柠檬螺原体（Spiroplasma citri）；如果生产中未使用或暴露于禽源材料，可不必检关节液支原体（M. synoviae）。

日本药典（简称JP）中的验证要求与EP基本一致，但在检出限验证中，JP 17未提及鸡败血支原体，但增加了唾液支原体的验证。

终待验证的支原体物种的选择，在依据药典基础上，还需根据支原体污染风险大小而定。污染风险的影响因素有支原体寄生的宿主细胞的特异性、原材料的来源、产品的应用领域等。

德国MB公司提供有10CFUTM支原体高敏标准品，可同时用于检测限和耐用性的验证。

 

关于检测限和耐用性的检测次数，有如下公式可参考：

检测次数 = 支原体物种数 × 3 轮独立检测 × 8个复孔/每个物种/每轮

以欧洲药典规定的9种支原体为例，实际所需检测次数为9 × 3 × 8 = 216 次检测。

加上阴性对照、阳性对照、无模板对照以及特异性验证，预计规格为250次/盒的试剂盒较为适合。

在NAT法的特异性验证方面，欧洲药典EP2.6.7指出，梭菌、乳酸杆菌和链球菌与支原体具有较近亲缘关系，应优先选择进行验证。

至于更具体的验证方案，还需要使用者针对自己的产品以及流程自行设计，德国MB公司也可协助完善。

二、德国MB公司提供的『支原体qPCR检测』方法的验证产品

下面列出的方法验证所需产品，具体有四个表，供使用者参考：

表1.『支原体qPCR检测』方法验证所需产品

 

表2. 特异性验证用标准品

根据EP2.6.7，梭菌、乳酸杆菌和链球菌与支原体具有较近亲缘关系，适合用于特异性验证。因此下表列出的是这3个菌属的产品。用户也可选择自己生产过程中可能会遇到的细菌进行特异性验证。

 

表3. 其他辅助产品

 

表4. qPCR方法验证所需设备、仪器

 

希望以上信息能给您带来帮助。

如您对以上产品感兴趣，需要订购或进一步咨询详情，请联系德国MB中国区总代理：北京缔一生物科技有限公司。