实验室细胞培养支原体污染怎么办？

在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。细胞培养中常遇见的有细菌污染、真菌污染、支原体污染、病毒污染等。说起支原体污染，估计细胞培养的同学就开始犯愁了，细胞培养的老手都知道，支原体污染非常不易察觉。有的实验室被支原体污染后，如果不进行有效*的支原体清除，该实验的细胞培养很难进行下去，细胞传代3代以后状态就急剧下滑，无法进行正常实验，有的实验室甚至只能指望换细胞间。那么怎样才能有效检测并清除支原体污染呢?

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养和器材要保证无菌；在细胞培养中加入适量的抗生素。

据了解，抗生素不能*根zhi支原体感染，停药后一段时间可以复发。因此，本文着重讲述细胞支原体污染预防之支原体快速检测和环境空间消毒方案，从根本入手预防解决细胞培养支原体污染问题。

1、支原体检测

市场上支原体检测方案琳琅满目，我们在做细胞培养时肯定不想在支原体检测上花费一天的时间，哪种方案最为快速有效？在这儿介绍一种可以在30分钟内完成支原体检测的试剂盒，该试剂盒是由我国苏州先达基因公司研发的，其原理是基于公司自主开发的实时荧光恒温核酸检测技术（ERA），可以在恒定的低温下（25℃-42℃）对痕量的支原体种内保守性DNA片段进行特异性的扩增，扩增反应可以在20min内完成，该试剂盒检测范围涵盖130种支原体。

ERA核酸扩增技术的核心是一套等温核酸扩增组合酶制剂。通过酶工程改造，将来源于细菌和病毒的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，通过不同的DNA扩增反应体系进行优化组合，从而获得8种酶蛋白为核心的等温扩增体系。配好的反应体系在各种实时荧光定量仪或者先达基因自主研发的简易恒温荧光检测仪中，可实现恒温扩增与荧光信号检测于一体，通过实时荧光扩增曲线在20min内就可通过检测仪的显示屏读出检测结果，检测过程无需开盖，避免气溶胶的产生，结果可靠性大幅度提高。ERA结合先达基因提供的一步法提取DNA的试剂，进一步简化了支原体检测操作，5min完成细胞液的DNA提取，20min完成支原体DNA分子检测，整个过程只需30min。

2、环境空间消毒方案

环境空间消毒包括：环境空气消毒、物体表面消毒、生物安全柜或超净工作台灭菌及培养箱消毒。目前大多数细胞培养室只是简单安装了臭氧消毒机，而从建立使用到后期从来没有经过大消毒（熏蒸灭菌），这给细胞培养环境微生物污染带来了极大的隐患和风险，因为臭氧消毒能力有限不稳定而且不能全面覆盖，无法杀灭微生物休眠体，单纯的臭氧消毒已不能深入的解决环境微生物问题，只能说是一种微生物水平控制的辅助手段。根据美国FDA、新版GMP及相关国际组织，现行的主流无菌室环境空间消毒是H2O2气体灭菌，环保无毒无残留，安全又快速。H2O2气体灭菌应用于细胞培养室消毒代替甲醛熏蒸将成为未来趋势。

H2O2干雾气体能快速杀灭细菌、真菌、支原体及病毒，法国欧菲姆H2O2干雾灭菌新技术应用于细胞培养室环境消毒则更具创新性和实用适用价值。

环境及人员操作污染风险大，干雾灭菌方法能把这种污染风险降至低，其灵活消毒的特点更能为微生物防控提供有力支撑，细胞房环境、培养箱等均可轻松进行灭菌处理而无需再投入过多的人力和物力，平常消毒及应急消毒可谓独yi无二。

法国欧菲姆H2O2干雾灭菌器源于欧盟GMP设计，自身符合洁净区净化要求，不带入任何外源污染的同时高效治疗洁净室空间微生物，达到无菌净化的目标。采用了先进的雾化技术，雾化颗粒小于3微米，增效了空间扩散均匀性，迅速弥漫充满整个密闭空间不放过每一处死角，灭菌效果堪称空qian绝hou，其均匀性、无残留及对机器无伤害特征非常吻合细胞房环境消毒及培养箱里面消毒。

欧菲姆干雾H2O2灭菌器源于欧洲法国，专门针对洁净厂房无菌室GMP设计，适应大空间灭菌，小空间灭菌更灵活。采用了先进雾化技术，雾化粒径平均达到3—5微米，配合空间杀孢子剂使用，灭菌效果能对嗜热脂肪杆菌芽孢降低6个对数值。

欧菲姆原理：欧菲姆采用独到而特殊的结构设计，使得在仅仅输入电能的情况下，集压缩、ventur喷射和雾滴内外部溅射碎化功能于一体，使专用液态杀孢子剂变成气雾状态极微小颗粒喷出，高速极小微粒与空气接触后充分气化，变成气态H2O2即为“干雾"。

深圳润联利用欧菲姆H2O2干雾灭菌器，针对不同行业的实验室以及医疗机构，会提出不同环境消毒控制经验，无论是P3实验室，无菌制剂生产车间，SFP动物实验室，深圳润联均有针对所在行业的具体空间消毒方案。

德国MB生产的Mycoplasma-offTM喷雾剂，或湿巾擦拭 5-10分钟清除，对支原体、细菌、真菌、霉菌、孢子祛除确切有效。无残留, 无腐蚀, 无致癌性，操作简单方便。

qPCR法介绍：

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。