细胞培养——对实验室的基本要求

细胞培养是一种无菌技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物和不受其他有害因素的影响。为防止微生物污染和有害因素的影响，细胞培养室要求环境清洁，空气清新、干燥、无尘。

细胞培养实验室由无菌操作区、孵育区、制备区、储藏区、清洗和消毒灭菌区6部分组成，这些区域的共同特点是房间要宽敞、明亮，地面要便于清洁、防滑，墙壁的质地光滑坚硬，仪器设备布局合理，方便操作，避免交叉干扰，陈设简洁，便于清扫。

一、无菌操作区

无菌操作区是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，较易造成污染。

因此，接种工作要在空气经过灭菌的环境里进行，小规模的无菌环境可利用超净工作台创造，大规模的需建无菌室。

理想的无菌操作室应划为三部分：

1. 更衣室―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

2.缓冲间―位于更衣间与操作间之间，用于准备工作，还有防止污染的作用，以保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱以及必需的小型仪器。

3.无菌操作间―无菌操作间则专用于无菌操作、细胞培养，其大小要适当，且其顶部不宜过高以保证紫外线的灭菌效果；墙壁光滑*以便清洗和消毒，无菌操作间容积小且为密闭式，一般无菌操作间的空气消毒用紫外线灯，有的实验室使用无臭氧紫外线消毒器或电子消毒灭菌器。

净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：

（1）侧流式或称垂直式。

（2）外流式或称水平层流式。

二、孵育区

孵育区也称培养区，本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行，后者费用高，一般实验室多采用孵箱进行工作。

三、制备区

制备区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。应设有试剂柜、器械柜、实验台和上水道、电源等，配备的主要仪器设备有水纯化装置、天平、微波炉、pH计、抽气泵、电炉、培养分装器、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶等。

在有天平、pH计、磁力拌器等设备下完成制备以后，应在无菌操作台进行过滤除菌。液体制备直接关系组织细胞养的成败，因此必须严格无菌操作。

四、储藏区

储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃。

细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般为4 ℃下存放30min。转放-20 ℃ 1 h，再转入-80—-70℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)。因此储存区必须配备冰箱、低温冰箱、超低温冰箱和液氮罐等设备。

五、清洗和消毒灭菌区

清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作，应备有高压蒸汽灭菌锅、细菌过滤设备、电热干燥箱、消毒柜、排风设备等。

六、细胞实验室的建设要求

1.环境要求

温度：仪器还是操作对温度没有特殊要求，维持舒适的温度即可，比如18~26度。

湿度：过高的湿度会导致微生物的滋生，所以建议正常维持湿度在70%以下。

洁净度：细胞实验对洁净区并没有要求，细胞实验里面只有细胞操作的时候要求无菌的环境，这时要求有局部的百级，通常可以利用超净台或者生物安全柜来实现，不过有时候为了有个更好一点的环境，减小超净台过滤器更换的时间，会维持室内的洁净度，比如万级的洁净度。

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行。

在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。

照明：满足实验用的操作照度，通常在300LUX。

2.围护结构要求

虽然实验的操作对大环境没有特殊要求，不过最好能有不产尘、不积尘的环境，能保证室内的清洁，并且易于清洗、不容易滋生微生物，所以在选择维护结构时，选用彩钢板、医疗板等洁净板材是比较好的选择，为了保证室内的通透性，可以布置密闭窗。

3.消毒

通常做完实验后，都需要做终末消毒，室内需要安装紫外灯，利用紫外灯对空气和表面消毒。

德国MB生产的Mycoplasma-offTM喷雾剂，或湿巾擦拭 5-10分钟清除，对支原体、细菌、真菌、霉菌、孢子祛除确切有效。无残留, 无腐蚀, 无致癌性，操作简单方便。

qPCR法介绍：

荧光定量PCR法（qPCR）：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。

优点：①灵敏度高、特异性强。

②时间短，2-3小时出结果。

③检测结果可定量。

④操作简便。

缺点：①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。（可用培养法做补充验证）

②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大（由于引物及内在设计不同），需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。