DIY外泌体专用血清的常用方法

外泌体大家应该都很熟悉。1983年，在绵羊网织红细胞中发现了现在生物学研究领域炙手可热的“小网红"——一种特殊囊泡结构，并与1987年正式被命名为“exosome"。

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。为细胞间通讯的重要媒介，它像一个信使，为细胞与胞外环境传递信息，保障机体的正常工作。

越来越多的科研人员投入到外泌体的研究中，根据PubMed统计显示，最近几年，外泌体研究呈爆炸增长。

外泌体的研究离不开细胞培养。以肿瘤相关外泌体研究为例，目前，收集肿瘤细胞外泌体主要有两种方法：

方法一

使用正常培液养细胞再换无血清培液收外泌体。

方法二

直接使用exosome-free FBS配制培养基用于培养细胞收外泌体。

从现有的一些研究可以看出[1][2][3][4][5]，研究人员更倾向于方法二，也就是使用exosome-free FBS培养细胞再收上清分离exosomes的方法，至少肿瘤研究方面是这样的。

相关文献[1] Zhou W , Fong M , Min Y , et al. Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis[J]. Cancer Cell, 2014.

[2] Boelens M , Wu T , Nabet B , et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways[J]. Cell, 2014, 159(3):499-513.

[3] Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J]. Nature Cell Biology, 2015, 17(6):816-826.

[4] Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Nature, 2020, 2015，527(7578):329-35.

[5] Melo S A , Luecke L B , Kahlert C , et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015, 523(7559):177-182.

所以，接下来就讲讲exosome-free FBS——无外泌体血清。

顾名思义，无外泌体血清就是外泌体含量极低，低到几乎没有的血清（以粒径分析结果为标准），获得主要有两种途径：

直接购买商品化的产品

自己DIY制备

如果选择自己制备无外泌体血清，常用的方法就是超速离心法。主要有三种策略：（前提是将血清用正确的方法*解冻，分装，按照实验需求选择合适用量进行去除外泌体的实验，血清解冻方法请参照这里👉：如何解冻血清才能大程度保证活性？）

将血清与培养基1：4比例稀释，然后超速离心10000g过夜收集上清；

直接将血清速离心10000g过夜收集上清；

180000g离心3-6小时收集上清。

P.S.其中，离心的过夜时间要视情况而定，一般在10-14小时之间，也可适当延长离心时间。

需要注意的是，离心后，外泌体会富集在试管底部，在吸取上层血清的时候，不要触碰底部沉淀，避免吸到沉底的外泌体，“一夜回到解放前"。

另外，只吸取80%左右的上层血清，其余的浑浊血清留作其他非外泌体用途细胞的培养，毕竟血清也挺贵的，避免不必要的浪费。

针对超速离心后的血清，可进行粒径检测（离心前样品和离心后样品），如果觉得纯度不够，再把离心后收集的血清做二次离心。

当然啦，以上方法也只是我们根据已有文献和相关实验室的经验总结得来的，仅供大家参考，如果有更好的方法，也欢迎在评论区和我们交流！

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