支原体常规检测方法汇总（三）

细胞培养过程中支原体检测方法如约而至

第三期来啦！

还没有看前两期内容的小伙伴

可以看我之前发的：支原体常规检测方法汇总（一）、支原体常规检测方法汇总（二）

上回书和上上回书说道

qPCR检测法是一种目前比较常用

效果也比较可靠的方法

那除了qPCR

还有没有其他方法可以检测呢？

所以今天就来讲讲

分离培养法和DNA染色法

有请两位主角闪亮登场

01、分离培养法

简单来说，这种方法的基本原理就是：分离，然后培养

听君一席话如听一席话，展开来讲，就是从可疑的细胞培养体系中取样，接种到适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上快速生长，最终形成明显可见的特征性菌落。

操作规范的情况下，这种方法很少会出现假阴性结果，检测精确度很高，因此被誉为支原体检测金标准。

缺点就是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。另一方面，尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. Hyorhinis。因此，该方法能鉴定的支原体种类有限，成为它的另一个缺点。

02、DNA染色法

该方法的实验思路是：培养指示细胞、样品上清液收集、上清液接种、染色观察结果

这一波操作看起来有点复杂，那展开说说：

将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero 细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞，供试品应对该细胞生长无影响。下面以Vero细胞为例）中培养后，用特异荧光染料（如Hoechst 33258）染色，支原体中的核酸也可以被着色，因此，如果待检测细胞中含有支原体，那么就会导致指示细胞被感染，进而在细胞膜或培养基等处发现蓝色荧光（支原体附着在细胞膜上，也有可能游离在细胞培养基中）。

指示细胞培养：将指示细胞复苏、传代，调整至最佳状态，留出适宜的量备用。

样品上清液收集：无抗生素培养基中加入待检测样品后，细胞需至少传一代，然后取细胞已长满且3 天未换液的细胞培养上清液待检。（为了对待检测样品中的支原体进行富集）

上清液接种：在制备好的指示细胞培养板中加入一定量的待检细胞培养上清，36°C培养3-5 天。指示细胞培养物至少传代1 次，末次传代培养可用6孔板培养3-5 天。

染色观察：吸出培养孔中的培养液，加入固定液，放置5分钟。吸出固定液后进行10min的二次固定，再次吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥。加DNA 染料工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，漂洗3次，干燥，封片。用荧光显微镜观察。

荧光显微镜下可见细胞表面或培养基中，有大小不等、不规则的蓝色荧光着色颗粒，则说明有可能存在支原体污染。

对于DNA染色法方法，优缺点也是很明显的：

优点：

1、适用于一些不易培养的支原体，如猪鼻支原体，分离培养法对该支原体检测并不可靠，但可用DNA染色法准确地检测出来。

2、操作步骤虽然多，但都相对简单

3、灵敏度尚可。

缺点：

1、时间较长，从Vero细胞复苏、传代，再到收集上清后再次培养，有时甚至需要十几天时间

2、存在假阳性和假阴性的可能：如一些死亡细胞释放出来的DNA会被染成蓝色，出现假阳性；或是由于荧光过若而出现假阴性使结果出现偏差，因此使用这个方法需要一定的经验。