细胞培养的具体步骤

科研实验中，细胞的体外培养一直是一个重要环节。细胞要养好，就要用好血清，如Ausbian®特级胎牛血清，它适合各种细胞培养，尤其适合难养细胞，如：干细胞、肝细胞，神经细胞，原代培养、细胞融合、转染细胞等。

那么细胞培养时都要㝍步骤呢？

一、常用设备

1. 准备室的设备

单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

2. 培养室的设备

液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

3. 必须放在无菌间的设备

离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

二、无菌操作

（一）无菌室的灭菌

1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或新洁尔灭或0.5％过氧乙酸擦拭。

2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射。

3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟。

4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

（二）实验人员的无菌准备

1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。

3.用75％酒精棉球擦净双手。

（三）无菌操作的演示

1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。

2.靠近酒精灯火焰操作。

3.器皿使用前必须过火灭菌。

4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。

6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

三、器械的清洗和消毒

（一）玻璃器械洗消

新的玻璃器皿的洗消

1.自来水刷洗，除去灰尘。

2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。

6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。

7.高压消毒后烘干