细胞培养用液的配制与消毒

器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤：

（一）水的制备

细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

（二）PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)

1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4-H2O 1.56 g，KH2PO4 0. 2 g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000 ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

（三）胰蛋白酶溶液的配制与消毒

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力很强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

（四）青、链霉素溶液的配制于消毒

1.所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4 ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5 ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克

（五）RPMI1640的制备与消毒

1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中)，充分搅拌至粉剂全部溶解，并按照包装说明添加一定的药品。然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5 ml，使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000 ml，摇匀。

2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。

3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。

4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。

5.使用前要向100 ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。

（六）血清的灭活

细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

（七）HEPES溶液

HEPES的化学全称位羟yi基呱嗪乙硫磺酸（N’
-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50 mmol/L，一般培养液内含20 mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。

1 mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20 mmol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20 ml三蒸水中，过滤除菌后可*（20 ml）加入1 L培养液中，或者每100 ml培养液中加入2 ml即可。

（八）谷氨酰胺

合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4 mmol/L。可以配制200 mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100 ml即配成200 mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1 ml谷氨酰胺溶液。

（九）肝素溶液的配制

含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

（十）Ⅰ型胶原酶

0.1%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

（十一）明胶溶液

因为明胶难于过滤，所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）-即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是0.1的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4℃保存。

（十二）其他培养用液的配制：

20ug/ml内皮生长因子

注意事项：

1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。

2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米 和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。

在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。细胞培养中常遇见的有细菌污染、真菌污染、支原体污染、病毒污染等。说起支原体污染，估计细胞培养的同学就开始犯愁了，细胞培养的老手都知道，支原体污染非常不易察觉。有的实验室被支原体污染后，如果不进行有效*的支原体清除，该实验的细胞培养很难进行下去，细胞传代3代以后状态就急剧下滑，无法进行正常实验，有的实验室甚至只能指望换细胞间。那么怎样才能有效检测并清除支原体污染呢?

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