培养中常出现一些黑点，是污染吗？

现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，*是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。

那么在细胞培养时，首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的)，也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。

如何预防细胞培养中黑点的产生?

掌握细胞传代的最佳时机，不要细胞长老了再传代;掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片;减少血清等试剂的冻融次数;将培养液的PH调到最佳;严格控制水质和器皿的清洁。

黑点已经产生了，如何进行处理?

如果判定黑点是污染，请及时将细胞处理后丢弃。其他情况，可参照以下进行：

如果是悬浮细胞：收集细胞上清慢速离心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更换新的培养瓶;如果是贴壁细胞：将细胞用PBS洗2-3遍，洗的时候，轻轻拍打培养瓶，让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落，再弃去PBS，消化时先加低浓度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来，去掉低浓度胰酶，然后正常消化细胞，将收集的细胞悬液慢速离心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更换新的培养瓶，并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。

支原体污染不仅是细胞培养中需要克服的现象，而且是制药、生物制品生产中需要加以避免的。支原体污染的影响是什么？

支原体常规PCR法其原理和荧光定量PCR是一样的，根据支原体核糖体的特异保守序列设计引物，对待检样本DNA进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出判断。

它的优点是准确度很高，特别是德国MB的试剂盒，不仅qPCR的灵敏度可以达到10CFU/ml以上，普通PCR的灵敏度也可以达到各国药典的这个要求。

特异性强，*涵盖所有可能感染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的9种支原体），根据序列一致性，至少可以检测到107种支原体物种。与细菌和真核DNA无交叉反应。

操作比qPCR多了个跑电泳的步骤。

时间短，2-3小时可以出结果。

唯yi的限制，因为检测的是支原体的DNA，所以无法区分活的支原体。但生物制品在生产过程中，本身不应该产生支原体污染，污染过也不行，所以这个限制反而变成了优点。