PCR实验的污染来源都有哪些？

PCR实验的污染来源都有哪些？

样本间交叉污染：收集样本的容器被污染或样本密封不严导致外溢；不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖；移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌；不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散，相互交叉污染。

实验试剂污染：主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中，因为PCR试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得PCR试剂和PCR板/管处于0℃，但这个过程也充满污染风险。

扩增产物污染：大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖，这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

那么对于【细胞和生物制品】及其生产过程中【支原体】污染的检测，有什么PCR检测方法吗？

• 常规PCR Kit （经典法）(不含Taq酶）

特点

1.内控对照为独立包装，遵循欧洲药典和日本药典操作流程。

2.高特异性，仅一条阳性对照条带，即可涵盖所有可能感染细胞的支原体物种。操作简单，

易于观察。

3. 高灵敏度，若PCR反应体系加入10μl样本，支原体检测限度为≤5或≤10CFU。

(详见下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10种常见支原体检测限“)

4.欧洲药典要求的26种支原体均可检出。该试剂盒可检测出1种脲原体、7种无胆甾原体和85种支原体，与细菌和真核DNA无交叉反应。

5.试剂盒中不含Taq酶，可另外购买。推荐使用德国MB公司专用Taq酶。(货号: 53-1050)

Venor® Gem Classic Kit

10种常见支原体检测限

操作步骤

第1步：样本处理

a. 细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本

说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。

②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。

建议：样本做DNA抽提处理，实现最高灵敏度。

推荐：德国MB公司生产的专用支原体DNA提取试剂盒，Venor® Gem Sample Preparation Kit。该DNA抽提试 剂盒已经过广泛验证。

第2步：试剂制备

第3步：PCR体系建立

a. 细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本

第4步：启动PCR反应

第5步：电泳结果分析

191bp为内控对照条带，表明PCR反应正常。

当样本存在支原体污染时，由于内控对照与支原体DNA存在竞争，内控对照条带变弱（例如支原体DNA＞103拷贝）。

阳性对照中支原体DNA＞104拷贝，内控对照条带会*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的条带，此条带不影响检测结果。

如果待测样本对PCR产生抑制，则内控对照条带变弱（和阴性对照相比），此时应先进行DNA抽提（推荐使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原体DNA抽提试剂盒，详见第25页），然后再检测。

储存条件

2~8℃至少6个月。复溶后在-18℃保存。