防止实验污染都有哪些措施？

PCR实验的污染来源都有：样本间交叉污染、实验试剂污染、扩增产物污染

防止实验污染都有哪些措施？

对于低流行地区，PCR检测人员经过严格培训上岗后，核酸污染的风险相对较小，但在疫区超负荷工作时，就可能会遇到核酸污染的问题，可通过以下措施降低污染机会：

正确佩戴手套：手套未紧密贴合拇指、食指和中指，在进行开盖操作时容易发生交叉污染。

正确使用生物安全柜：简单、整洁、避免通风口堵塞；操作前后紫外线照射，消毒剂随手可及；废液缸里有1/3体积的含氯消毒液，并且及时清理废液缸，保证废物不超过废液缸体积的2/3。

核酸提取仪去污染：每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。

重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30min。

PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。

实验室随手可及的消毒剂。

• 常规PCR Kit （经典法）(不含Taq酶）

特点

1.内控对照为独立包装，遵循欧洲药典和日本药典操作流程。

2.高特异性，仅一条阳性对照条带，即可涵盖所有可能感染细胞的支原体物种。操作简单，

易于观察。

3. 高灵敏度，若PCR反应体系加入10μl样本，支原体检测限度为≤5或≤10CFU。

(详见下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10种常见支原体检测限“)

4.欧洲药典要求的26种支原体均可检出。该试剂盒可检测出1种脲原体、7种无胆甾原体和85种支原体，与细菌和真核DNA无交叉反应。

5.试剂盒中不含Taq酶，可另外购买。推荐使用德国MB公司专用Taq酶。(货号: 53-1050)

Venor® Gem Classic Kit

10种常见支原体检测限

操作步骤

第1步：样本处理

a. 细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本

说明：①样品基质可能会影响检测的灵敏度。收集和筛选更高的样品量可提高测定灵敏度。

②细胞培养物样本含丰富的DNA酶，在低温下也能降解支原DNA，影响检测灵敏度。

建议：样本做DNA抽提处理，实现最高灵敏度。

推荐：德国MB公司生产的专用支原体DNA提取试剂盒，Venor® Gem Sample Preparation Kit。该DNA抽提试 剂盒已经过广泛验证。

第2步：试剂制备

第3步：PCR体系建立

a. 细胞培养上清

b. 生物药或需遵循药典的样本

第4步：启动PCR反应

第5步：电泳结果分析

191bp为内控对照条带，表明PCR反应正常。

当样本存在支原体污染时，由于内控对照与支原体DNA存在竞争，内控对照条带变弱（例如支原体DNA＞103拷贝）。

阳性对照中支原体DNA＞104拷贝，内控对照条带会*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的条带，此条带不影响检测结果。

如果待测样本对PCR产生抑制，则内控对照条带变弱（和阴性对照相比），此时应先进行DNA抽提（推荐使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原体DNA抽提试剂盒，详见第25页），然后再检测。

储存条件

2~8℃至少6个月。复溶后在-18℃保存。