干货分享：细胞转染全攻略（中）

 

- 优质血清助力细胞学实验 -

上期内容里，我们介绍了细胞转染的基本基本知识，包括概念、应用场景以及各种方法之间的优劣对比。

本期内容，进一步为大家介绍常用的细胞转染方法——实操篇。

- 细胞转染常用方法 -

阳离子脂质体介导的转染

原理：阳离子脂质体介导的转染是目前常用的转染方式之一。

阳离子脂质的基本结构由带正电荷的头基和一个或两个烃链组成。

带正电荷的头基与带负电荷的核酸通过静电作用形成复合物。

经细胞的内吞作用进入细胞。

实验过程：将DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和转染试剂分别在不同的管中稀释→将两者混合形成混合物→将形成的混合物加入细胞中，脂质体的正电荷有助于帮助复合物粘附到细胞膜上→复合物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

磷酸钙共沉淀

原理：将DNA与氯化钙在磷酸缓冲盐水中混合形成磷酸钙-DNA沉淀物，然后将其分散在培养的细胞上，磷酸钙促进共沉淀物中的缩合DNA与细胞表面的结合，DNA通过内吞作用进入细胞。

实验过程：将氯化钙和DNA混合，以可控的方式加入磷酸缓冲液→在室温下孵育，以形成极细，可溶的共沉淀微粒→将磷酸钙-DNA沉淀物加入细胞中，后者能黏附到细胞膜表面→共沉淀物经细胞内吞作用进入细胞→检测基因表达或沉默情况。

病毒转染

原理：对于用脂质体不能实现转染的细胞，可以采用病毒转染。腺病毒，逆转录病毒和慢病毒载体已广泛用于哺乳动物细胞体内外的基因转染。

 

实验过程：通过基因克隆方法获得重组病毒表达载体→转染包装细胞系，扩增并分离得到重组病毒颗粒→纯化并滴定病毒液→转导目的细胞（含病毒特异性的受体）→从培养基中移除病毒→检测基因表达或沉默情况。

电转

原理：利用电脉冲在细胞膜上形成暂时的孔使核酸物质能穿过孔进入细胞。

实验过程：利用电转缓冲液重悬细胞→对含有核酸，缓冲液，细胞的混合物给予合适的电脉冲→电脉冲在细胞膜上形成电势差，诱导产生暂时的孔使核酸进入细胞→将细胞返回到生长培养基中，使其慢慢恢复→检测基因表达或沉默情况。

血清在细胞培养过程中的重要性不言而喻：

• 提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

• 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力。

• 有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

• 是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

• 起酸碱度缓冲液作用。

• 提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

• 参与细胞冻存。

• ......

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